納米顆粒示蹤分析（NTA）以高分辨率、逐個(gè)顆粒分析而聞名，但我們所說(shuō)的“高分辨率"究竟是什么意思呢？這篇技術(shù)文章探討了Nanosight Pro繪制分布數(shù)據(jù)使用的兩種方法，旨在提高多分散顆粒分析的置信度。

在NS Xplorer 軟件的視野內(nèi)，可以看到顆粒布朗運(yùn)動(dòng)下的移動(dòng)。軟件默認(rèn)記錄5個(gè)750幀的視頻，然后逐幀識(shí)別并追蹤可視顆粒中心點(diǎn)。軟件計(jì)算每顆粒子沿X和Y平面移動(dòng)的平均距離，從而計(jì)算均方位移（MSD）。隨后，通過(guò)Stokes-Einstein 方程將MSD轉(zhuǎn)化為流體動(dòng)力學(xué)直徑（d_h）。

NS Xplorer（以及以前的NTA軟件版本）算法必須通過(guò)追蹤粒子足夠步數(shù)的布朗運(yùn)動(dòng)，以準(zhǔn)確確定步長(zhǎng)的平均值，從而獲得流動(dòng)力學(xué)粒徑。然而，小顆粒受散射體積和它們?cè)谝曇皟?nèi)保持的有限shi長(zhǎng)（例如，在每秒30幀（fps）的情況下，<10幀=0.3s）所限制。這些局限性偶爾會(huì)表現(xiàn)為粒徑分布的人為展寬，而平均粒徑仍保持準(zhǔn)確。

為了解決這個(gè)問(wèn)題，NS Xplorer和NTA軟件采用了一種數(shù)學(xué)模型來(lái)補(bǔ)償布朗運(yùn)動(dòng)中的有限軌跡（Saveyn等人，2010）。該模型被稱為“有限軌跡長(zhǎng)度調(diào)整（Finite track lengh adjustment, FTLA）"。FTLA補(bǔ)償了增寬效應(yīng)，并呈現(xiàn)調(diào)整后的分布寬度（圖1）。

圖1：FTLA模式適用于包含多個(gè)離散并可分辨群體的樣品。FTLA進(jìn)一步幫助獲取100nm乳膠球的單分散粒徑分布。

FTLA通常適用于單分散樣品或者具有雙峰或三峰混合離散群體的多分散樣品。原始信號(hào)數(shù)據(jù)分析模式RAW分布則為更多的多分散樣品提供了更深入的見(jiàn)解，并確保在更復(fù)雜的系統(tǒng)中具有良好的測(cè)量再現(xiàn)性。

圖2顯示了FTLA (藍(lán)色)和RAW（紅色）分布，RAW分布模型下，復(fù)雜樣品的多分散性增加。Raw模型反映了樣品的“真實(shí)"異質(zhì)性，具有較寬的粒徑分布，但不會(huì)影響主分布的單個(gè)肩峰的分辨率。

圖2：RAW模型（Red）適合連續(xù)粒徑分布的多分散樣品

下圖進(jìn)一步說(shuō)明FTLA和RAW分布如何影響數(shù)據(jù)的再現(xiàn)性。

圖3：RAW和FTLA呈現(xiàn)的外泌體粒徑分布

圖4：外泌體FTLA粒徑分布展示出低再現(xiàn)性

RAW分析可能更適合多分散族群，而FTLA可能更著重離散族群從而降低測(cè)試之間的可重復(fù)性（圖4）。

FTLA算法基于預(yù)測(cè)每個(gè)粒子在無(wú)限長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的單個(gè)路徑長(zhǎng)度，提供窄的粒徑分布峰。FTLA算法將大小相似的顆粒分組到不同分布組距。然而，當(dāng)樣品高度多分散時(shí)采用FTLA模型更具挑戰(zhàn)性，因?yàn)椴煌牧绞菇M距之間的區(qū)分變得更復(fù)雜。在FTLA模型下，最終的分布圖不同測(cè)量的最終分布圖看起來(lái)重復(fù)性差。繪制RAW分布可以減輕這種變化，從而在許多測(cè)量中具有更好的再現(xiàn)性（圖5）。

圖5：外泌體RAW粒徑分布展現(xiàn)出高再現(xiàn)性

FTLA和RAW模式對(duì)評(píng)估離散族群都有幫助。RAW分布可能呈現(xiàn)出一個(gè)單峰，該峰可能看起來(lái)像主組群一側(cè)的肩峰。從RAW切換到FTLA進(jìn)一步證實(shí)主峰中第二個(gè)峰的存在，表明樣品中很大一部分顆粒粒徑更大（圖7）。

圖6：納米氣泡的RAW粒徑分布

圖7：納米氣泡的FTLA粒徑分布

總結(jié)

下表總結(jié)歸納了使用納米顆粒示蹤分析粒徑分布時(shí)，該如何在FTLA或RAW分析模式中做出選擇，供廣大用戶參考。